CONTROL DE MICOTOXINAS EN ALIMENTACIÓN Y SALUD PÚBLICA

BYRON ENRIQUE BORJA CAICEDO Y M. DE LOS ÁNGELES CALVO TORRAS

Resumen: Las micotoxinas son compuestos tóxicos derivadas del metabolismo secundario de los hongos filamentosos. Los principales géneros productores son Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Los hongos filamentosos colonizan y contaminan los granos, alimentos, piensos y otras materias primas utilizadas para su elaboración, causando un impacto negativo tanto en la salud del hombre como de los animales y constituyendo un problema de salud pública. Las micotoxinas junto a los efectos carcinogénicos que pueden desencadenar, también se han descrito como potentes agentes inmunosupresores, mutagénicos y teratogénicos. El descubrimiento de las aflatoxinas en los años 60 ha dado lugar al inicio de estudio de las micotoxinas, que ha determinado que se fijen límites máximos aceptables para las distintas micotoxinas presentes en alimentos y piensos, ocasionando el establecimiento de una amplia legislación y reglamentos específicos sobre micotoxinas en el ámbito nacional e internacional. Un aspecto fundamental en la determinación de las micotoxinas es el establecimiento y ejecución de una técnica analítica correcta. La secuencia de procedimientos que deben llevarse a cabo son: muestreo, extracción, purificación, técnicas de exploración y técnicas de confirmación. Actualmente, entre las metodologías descritas para el procesamiento de muestras, podemos citar: Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extration, SPE) y sus variantes como la Microextracción en Fase Solida (SPME) y Extracción con Columna de Intercambio Iónico (Ion Exchange Column). Asimismo, se han diseñado técnicas para confirmación, como: sistemas de Cromatografía en Capa Fina (TLC), la Cromatografía Líquida (CL) , Cromatografía Gaseosa(CG) etc., incrementándose así, de manera indiscutible, la capacidad de analizar las micotoxinas con más precisión y seguridad, Debemos destacar que Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) es una técnica de elección, utilizada e indicada para el tratamiento de muestras y que acoplada ala espectrometría de masa (MS/MS) ha resultado de gran interés y valía. Otro aspecto fundamental que debemos considerar es prevenir y controlar la posible contaminación por hongos productores de micotoxinas. Ésta, es una labor preponderante que se fundamenta en la trazabilidad y aplicación de las BPA (Buenas Prácticas Agrícolas), BPM (Buenas Prácticas de Manufactura), BPAL (Buenas Prácticas de Almacenamiento), y las APPCC (Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control). Paralelamente debemos indicar que se dispone de métodos para poder minimizar o neutralizar a las micotoxinas siendo estos métodos Físicos, Químicos y Biológicos que al ser bien utilizados pueden contribuir al descenso o probable eliminación de las micotoxinas salvaguardando así la salud humana y animal.

Palabras clave: micotoxinas, control, prevención, salud pública.

Introducción

La palabra Micotoxina, deriva del griego mikos y del latin toxicum, que significan hongo y tóxico respectivamente. Las micotoxinas son metabolitos secundarios produci­dos y acumulados por hongos filamentosos: Son productos de bajo peso molecular que se originan, principalmente, al final de la fase exponencial o al inicio dela fase estacionaria de crecimiento de los hongos. Aunque se indica la capacidad de todos los hongos filamentosos de producir micotoxinas, las más estudiadas son las producidas por especies de los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Las especies de estos géneros, colonizan y contaminan sustratos que son utilizados en la alimentación humana y animal constituyendo un grave problema de salud pública. Conjuntamente se ha indicado que la presencia de las micotoxinas en los alimentos puede ser de manera individual o simultánea con otras, lo que puede ocasionar efectos de sinergismo en su acción sobre el organismo, aumentando así su toxicidad.

El entorno global del problema de las micotoxinas está basado en las micotoxicosis humanas bien documentadas como el ergotismo en Europa, denominado como “fuego del infierno”, debido a las alucinaciones, psicosis, delirios, convulsiones, sensación de quemazón y necrosis distal, que se producían como resultado de la ingestión de alimentos preparados con cereales contaminados con alcaloides del cornezuelo o Claviceps purpurea. La micotoxicología moderna tiene su inicio en el año 1960 debido al descubrimiento de las aflatoxinas, a raíz de una crisis veterinaria que ocurrió cerca de Londres y en la que murieron alrededor de 100.000 pavipollos. En la época los científicos concluyeron que la causa estaba asociada al alimento, específicamente a una harina de maní importada del Brasil. Logrando aislar una sustancia producto del crecimiento de un hongo que al ser suministrada a animales sanos produjo una sintomatología muy compatible con la desconocida enfermedad, quedando demostrado que dicha sustancia había sido producida por una cepa de Aspergillus flavus de la cual derivó su nombre de Aflatoxinas.

Deben existir condiciones favorables de crecimiento para las micotoxinas, como una elevada actividad de agua y temperatura, las que afectan principalmente a los cereales. Pueden formarse tanto en el cultivo del alimento en campo, como durante la recolección, transporte y almacenamiento. Además, al ser termoestables y resistentes, persisten durante la molienda, lavado y procesado de los productos alimenticios, ingresando así en la cadena alimentaria. La incidencia de micotoxinas en la producción de animales, especialmente aves y cerdos ha representado uno de los mayores problemas que inquietan a importantes sectores productivos. Entre los efectos adversos que puede traer consigo el consumo de alimentos contaminados se encuentran la drástica reducción de la productividad, caracterizada por una disminución de la velocidad de crecimiento y una baja eficiencia alimentaria. Esta influencia negativa se debe principalmente a interferencias producidas por las micotoxinas sobre diversos sistemas enzimáticos ligados al proceso digestivo y del metabolismo de los nutrientes así como el sistema inmunosupresor.

Para la salud humana las micotoxinas han representado una amenaza latente, pues pueden actuar como un “asesino silencioso” ya que su consumo en dosis muy pequeñas no induce síntomas clínicos evidentes, pero con el tiempo puede traer graves consecuencias sobre la calidad y durabilidad de la vida.

Las micotoxinas producen micotoxicosis agudas y crónicas que afectan principalmente al hígado, riñón y sistemas inmunológico y reproductor. Además, algunas de ellas como las aflatoxinas (AFLs) han sido reconocidas por la International Agency for Research on Cancer (IARC) como los compuestos naturales con mayor potencial cancerígeno para humanos que se conocen, aparte de ello también posee efectos inmunosupresores, mutagénicos y teratogénicos, seguidas por la ocratoxina A (OTA), fumonisinas (FBs), deoxinivalenol (DON), zearalenona (ZEA), patulina (PAT) y citrinina (CIT) En similitud de condiciones.

Los factores que influyen preponderantemente sobre la toxicidad de las micotoxinas en los seres vivos son: La biodisponibilidad y toxicidad de la micotoxina, los sinergismos entre ellas, la cantidad de micotoxina ingerida diariamente en función de la concentración de micotoxina y de la cantidad de alimento ingerido, la continuidad o intermitencia de ingestión del alimento contaminado, el peso del individuo y el estado fisiológico y de salud de éste y la edad del individuo. Por otro lado los niños y los animales jóvenes son más susceptibles a la toxicidad de las micotoxinas debido a una mayor variación del metabolismo basal.

Los hongos con capacidad toxigénica se consideran un problema de difícil solución e inevitable por lo que cada país ha propuesto regulaciones para la cantidad de aflatoxinas en los alimentos siendo que estas son las más representativas se ha mencionado que en los Estados Unidos el máximo permitido es de 15-20 mg/kg en alimentos y 0.5 en leche; la comunidad Europea considera un valor máximo de 5mg/kg y 0.5 mg/kg respectivamente; la mayoría de países latinoamericanos tiene regulaciones muy laxas como por ejemplo Colombia que acepta concentraciones del orden de 50mg/kg.

La Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO) estima que las micotoxinas afectan a una cuarta parte de los cultivos a nivel mundial, incluyendo alimentos básicos como el maíz, semillas de algodón y frutos secos. Es menor pero no menos importante la contaminación de productos de origen
animal como los huevos, la carne o la leche como consecuencia de la ingestión de piensos contaminados con micotoxinas por parte de los animales.

A nivel mundial, por lo menos 99 países han establecido reglamentos que definen los límites tolerados para las micotoxinas en productos vegetales, alimentos y piensos, las principales reglamentaciones en diversos países van dirigidas a las aflatoxinas. La población total en los países con reglamentos representó aproximadamente el 87 % de los habitantes del mundo. En América Latina se sabe que 19 países, que representan el 91 % de la población de la región, cuentan con reglamentaciones específicas sobre micotoxinas. En el Mercado Común del Sur (MERCOSUR), el llamado bloque comercial integrado por países como Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay existen reglamentos en común 117control de micotoxinas en alimentación y salud pública
para las aflatoxinas. Los reglamentos para aflatoxinas en los alimentos son a menudo fijados para el total de las aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 . En América del Norte en los Estados Unidos y el en Canadá desde hace muchos años están vigentes reglamentos para las micotoxinas y se implementan técnicas avanzadas de muestreo y análisis. En ambos países, los límites para las aflatoxinas se han fijado para la detección conjunta de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 . En Europa, 39 países, representando aproximadamente el 99% de la población del continente, contaban con reglamentos específicos para micotoxinas en el año 2004. En la UE, existen reglamentos armonizados para las aflatoxinas en diversos alimentos, para la aflatoxina M 1 en la leche, para la ocratoxina A en los cereales y en los frutos secos de la vid, para la patulina en el jugo de manzana y en productos de la manzana y para la aflatoxina B 1 en diversas raciones. Se han fijado límites guía para el deoxinivalenol en los cereales y en los productos derivados de cereales . Se sabe que en el continente Africano quince países cuentan con reglamentos específicos para las micotoxinas. Estos países cubren aproximadamente el 59% de la población del continente. Veintiséis países en Asia/Oceanía cuentan con reglamentos específicos para las micotoxinas (88% de la población de la región). Los reglamentos para las aflatoxinas totales son los dominantes en los alimentos, en tanto que prevalecen en las raciones los reglamentos para la aflatoxina B 1 . Australia y Nueva Zelanda han armonizados sus reglamentos para las micotoxinas. De lejos, los reglamentos más extensos y detallados se encuentran en China y en la República Islámica de Irán.

El control de las micotoxinas en la alimentación y salud pública es un trabajo de revisión bibliográfica, con un enfoque en propuestas y estrategias de
control y prevención utilizadas por los organismos oficiales, para controlar y minimizar los problemas de contaminación que los hongos filamentosos y sus metabolitos secundarios ocasionan una vez formados en el sustrato, evitando las pérdidas económicas y que se produzcan enfermedades en el hombre y los animales y así favorecer la seguridad e inocuidad alimentaria y una mejor calidad de vida.

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS

A partir del descubrimiento de las micotoxinas sus técnicas han sufrido a lo largo del tiempo considerables transformaciones, mejorando la precisión y seguridad en los métodos analíticos que permitan extraer, purificar, cuantificar e identificar los metabolitos fúngicos en diferentes tipos de alimentos, piensos y matrices biológicas, impulsando además la inspección de grandes volúmenes de muestras en cortos periodos de tiempo con la mayor exactitud y resultados posibles. “En la actualidad la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC, Association of Official Analytical Chemists), ha aprobado y publicado más de 40 métodos de análisis de micotoxinas para una serie de alimentos, existiendo también métodos como los de la Organización internacional para la Normalización (ISO, International Organization for Standardization,) y el Comité Europeo de Normalización (CEN, European Committee for Standardization). En el caso de España, existe la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR), que adopta y traspone las normar ISO y CEN en normas españolas (UNE). En los últimos años se han presentado recopilaciones de técnicas de análisis de micotoxinas en diferentes tipos de sustratos. Se han recomendado también la aplicación de procedimientos analíticos de calidad (AAC) que incluyen los materiales con su respectiva referencia de certificación en especial en muestras que requieran análisis de una elevada precisión y compatibilidad.

Las micotoxinas de mayor relevancia y de importancia mundial sobre las cuales se han trabajado en su análisis han sido: Aflatoxinas (AFs) que son producidas principalmente por cepas de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus en cultivos agrícolas como el maíz, el maní, la semilla de algodón o cacahuates y frutos secos, pueden contaminar cultivos en el campo durante la cosecha o durante el almacenamiento ) . Ocratoxina A (OTA) contamina alimentos de consumo humano, principalmente cereales y derivados, bebidas alcohólicas y productos de molienda (café, cacao), sus niveles están relacionados con las condiciones de producción y conservación. Fumosinas B 1 (FB s ) son producidas principalmente por dos especies fúngicas, asociadas al cultivo de cereales Fusarium verticillioides y Fusarium proliferatum, las fumosinas son contaminantes frecuentes del maíz de consumo humano y animal. Deoxinivalenol (DON) es producida por el género Fusarium, pertenece al grupo de los tricotecenos, el paso del deoxilivalenol a la cadena alimentaria a través de los animales y sus productos es poco probable, ya que estos son eliminados rápidamente y es escasa la acumulación en el organismo, esta toxina puede llegar a los humanos a través de cereales y sus derivados (cereales, pan, pasta, cerveza, etc.). Zearalenona (ZEA) producida principalmente por F. graminearum y F. culmorum, se forma principalmente en la post-cosecha de los cereales como el trigo, y soja principalmente, por adecuadas prácticas de higiene y conservación de los cereales durante el transporte y almacenamiento o condiciones climáticas favorables para el desarrollo del hongo productor. Patulina (PAT) proviene de varias especies fúngicas de género Penicillum, principalmente cepas de P. expansum (podredumbre azul de las manzanas) es la especie más frecuente y las toxinas T-2 (T2) y HT-2 (HT2) son micotoxinas clasificadas como tricotecenos de tipo A producidas por cepas del género Fusarium, se detectan en cereales como la avena, trigo, maíz, arroz y sus productos derivados en general la concentración de la toxina HT-2 representa 2/3 de la suma total de la concentración de T-2 y HT-2.

Una metodología adecuada de análisis de micotoxinas consta de varias fases relevantes, y que podemos diferenciar en:

a) Muestreo; b) Extracción y Purificación; c) Técnicas de Exploración y d) Técnicas de confirmación.

a) Muestreo

El muestreo es una de las fases cruciales que reviste mucha importancia en el análisis de matrices sólidas y líquidas como por ejemplo los cereales y otras materias primas. Siendo que el muestreo en matrices líquidas arroja menor error que el de los sólidos, polvos y pastas representan aún un menor error.

La obtención de resultados acertados en el análisis de micotoxinas, su tamaño homogéneo con una ligera variación de peso, y su posterior análisis de laboratorio y si fuera necesaria también su repetición, así como la recolección y selección óptima y cualificada y mayores muestras garantizaran una adecuada evaluación posterior de los niveles de micotoxinas presentes. Se deberá tomar en cuenta la manera en que el alimento al ser muestreado se contaminó con micotoxinas, como por ejemplo los alimentos en los que se puede encontrar las micotoxinas como producto del metabolismo de piensos contaminados presentan una distribución más homogénea que es lo habitual en las micotoxinas, hay que recalcar que a menor tamaño de la partícula ésta podrá tener una concentración más elevada de micotoxinas, Por último se debería desarrollar un método de muestreo y submuestreo para cada alimento tomando en cuenta sus particularidades y cuál es el objetivo perseguido (34) . Oficialmente los métodos establecido por los protocolos de la Unión Europea que regulan las muestras y métodos analíticos de referencia para todas las micotoxinas legisladas en alimentación humana están estipulados en el Reglamento C.E. No 401/2006 por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de micotoxinas en los productos alimenticios y su modificación por los Reglamento 178/2010, 519/2014 han establecido los criterios de realización en la toma de muestras y análisis de micotoxinas en diferentes productos. En el caso de la alimentación animal el Reglamento 152/2009 y su posterior modificación por el Reglamento 691/2013 de la Comisión, en lo que se refiere a los métodos de muestreo y análisis., debe tenerse en cuenta que en caso de no obtener una muestra representativa, la concentración de micotoxinas puede estimarse erróneamente.

b) Extracción y Purificación

Los procedimientos analíticos se han basado en técnicas cromatográficas o de inmunoensayos que normalmente requieren de una extracción con disolventes apropiados para liberar la micotoxina de la matriz a investigar, en la mayoría de los casos cuando el sustrato es sólido se lo hace con un disolvente inmiscible y cuando el sustrato es líquido se usa una dilución con un solvente miscible apropiado. Además de una posterior etapa de purificación de la muestra que consiste en la separación de las micotoxinas de interés del resto de compuestos co-extraidos.

Se mencionan a continuación las técnicas de extracción y limpieza más utilizadas para el análisis de micotoxinas:

Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extration, SPE).- Es llamada así debido a que el material de soporte utilizado es un sólido, a través del cual pasa un líquido o gas, es una técnica fiable e ideal para muestras líquidas y para la preparación de muestras que necesitan una alta selectividad y sensibilidad en matrices alimentarias, además evita el elevado consumo de disolventes ya que no requiere de ellos, es una técnica muy económica y reutilizable, presenta los extractos sucios como un inconveniente. La SPE se emplea con frecuencia en el análisis de micotoxinas como tricotecenos (TCs), ocratoxina A (OTA) o fumonisinas FBs ) . Existen variantes como la extracción en fase solida convencional, la dispersión de matriz en fase sólida y la microextracción en fase sólida a la cual daremos una mayor significancia

Microextracción en Fase Sólida (Solid Phase Micro Extraction, SPME).-
Esta técnica es una variante de la extracción en fase sólida (SPME), mas por su gran desarrollo y aplicabilidad se ha transformado en una técnica independiente, su principal ventaja es que elimina la utilización de disolventes y depende de una escasa mano de obra, además agrupa los pasos de la extracción, concentración e inyección en un solo dispositivo, reduciendo el tiempo de trabajo y su manipulación, se destaca además por poder emplearse con un volumen reducido de muestra, ya sus desventajas son que es difícil para matrices complejas, en algunos casos la extracción es lenta y baja precisión, es de baja recuperación es aplicable a la extracción de ocratoxina A, entre otras.

Extracción en columnas de inmunoafinidad (InmunoAffinity Column, IAC) permite la extracción y purificación simultánea de las micotoxinas: AFs, OTA, FBs, DON, T-2 y HT-2, teniendo como desventajas el hecho que son de un solo uso unido a su elevado costo ).

Extracción con fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction, SFE) aporta una rapidez de preceso, entre 30 y 60 minutos con una alta selectividad y baja cantidad de disolventes (5-10 ml), su filtración posterior no es necesaria, sus inconvenientes están en el límite del tamaño de la muestra (<10g), la necesidad de modificadores para mejorar la eficiencia de la extracción y el coste elevado del equipo.

Extracción con microondas (Micro-Wave Assisted Extraccion, MWE) es sencilla, rápida y con un bajo consumo de disolventes (15-40ml), el inconveniente es el que el extracto obtenido debe ser filtrado, es necesaria la adición de un disolvente polar y es necesaria la limpieza posterior del extracto.

Extracción acelerada con disolventes (Accelered Solvent Extraction, ASE) es un método rápido, presenta un bajo consumo de disolvente (15-40ml), con un control absoluto de temperatura, presión, entre otros, con la desventaja de tener un elevado coste del equipo y dependencia en el tipo de matriz.

c) Técnicas de Exploración

Estas técnicas se aplican cuando se dispone de un número elevado de muestras a analikzar, se utilizan para realizar descartes de muestras negativas de una manera rápida reduciendo significativamente la cantidad de análisis. Son métodos que tienen una muy buena sensibilidad pero son muy poco selectivos, el inconveniente mayor radica en que se pueden dar falsos positivos ya que emplean anticuerpos monoclonales, siendo necesario el confirmar la muestras que dieran positivas antes de aseverar un resultado definitivo.

Las técnicas de exploración o screening más empleadas para el análisis de micotoxinas son los Inmunoensayos y los Biosensores.

Entre los Inmunoensayos citaremos:

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) es el método de elección para el control de micotoxinas en lo que se refiere a inmunoensayos por su gran versatilidad en la cantidad de muestras a ser analizadas y su velocidad, permitiendo determinar la concentración de un antígeno o un anticuerpo mediante el anclaje de uno de ellos a una fase solida mientras el otro queda en solución, esta técnica está indicada para las micotoxinas más comunes cuando estas se encuentran en niveles de contaminación natural como la Aflatoxina, Ocratoxina, Fumonisina, Zearalenona, analizadas en cereales, granos, alimentos, balanceados animales y bebidas. Las técnicas de ELISA se clasifican en directa e indirecta y se subclasifican en competitiva y no competitiva, las ventajas que presenta esta técnica son: Un menor consumo en reactivos y materiales, sencillez en la preparación de las muestras ya que requiere una menor pureza de los extractos, equipos sencillos y de bajo coste de mantenimiento, rápida lectura visual cualitativa o semicuantitativa de resultados y una elevada especificidad, sus desventajas son el coste, caducidad y poca disponibilidad de los kits para las micotoxinas de interés, posibilidad de reacciones cruzadas con otras micotoxinas o compuestos (21) . También se mencionan los inmunoensayos basados en membranas como el Ensayo de Flow-Through que se trata de un ELISA competitivo directo, en donde el anticuerpo anti-micotoxina se une a la superficie de la membrana los resultados positivos se cuantificaran por técnicas de HPLC, es una técnica muy adecuada para tomar decisiones a pie de campo o de fábrica. El ensayo Lateral Flow Test, utiliza tiras inmunocromatográficas produce una reacción competitiva entre la micotoxina de la muestra y el complejo monoclonal antimicotoxina, es un método semicuantitativo, rápido, de gran estabilidad, muy sencillo y fácil de ser usado en el campo, los resultados también deberán ser confirmados por HPLC.

RadioInmunoensayo (RIA), inhibe competitivamente la unión de un antígeno con marca radioactiva a un anticuerpo específico por parte del antígeno no marcado, existe también el RIA en fase sólida (RIAFS) y el RIA en fase líquida (RIAFL), son métodos rápidos simple y generan un buen ahorro en reactivos (K), el uso de la radiactividad hacen que sean de uso exclusivo de los laboratorios y pocas instalaciones de la industria también la utilizan.

Biosensores, podemos destacar que forman parte de las técnicas de exploración. Son un dispositivo compacto que incorpora un elemento de reconocimiento biológico (anticuerpo) asociado a un sistema de transducción, que permite procesar la señal producida por la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito (23) . Sus características son variadas como elevada sensibilidad, confiabilidad, tiempo de vida extenso, coste de producción bajo, tiempo de análisis corto, preparación de la muestra innecesario, fácil manejo, portátiles y multianálisis. Pero en general no permiten la realización el análisis simultáneo. Existe una amplia diversidad de biosensores y no todos cumplen con las características aquí expuestas. Los biosensores de mayor aplicación y las micotoxinas que estos analizan son: Biosensores de resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) en la detección de micotoxinas de los géneros Fusarium (zearalenona, DON y fumonisina B 1 ) y Aspergillus (Aflatoxina B 1 ); Biosensor fluorimétrico de inmunoafinidad y el Biosensor de Fibra óptica pàra detección de Aflatoxinas.

d) Técnicas Cromatográficas de confirmación

La cromatografía es una técnica que permite la separación dinámica de los componentes de una muestra en fase móvil y en fase estacionaria determinando los niveles permitidos de micotoxinas mediante procedimientos analíticos suficientemente sensibles y selectivos. Es también recomendable la aplicación
de procedimientos de aseguramiento analítico de calidad (AAC), que garantizaran el grado de precisión.

A continuación, se detallan las técnicas de confirmación cromatográficas en el análisis de micotoxinas más empleadas en los últimos años:

– Cromatografía de Capa Fina (CCF) o Thin Layer Chromatography (TLC), ha sido un método de elección a partir del descubrimiento de las aflatoxinas, para muchas otras micotoxinas especialmente en investigación, o para confirmación de resultados positivos por ELISA, fue adoptado como método oficial establecido por la Association of Analytical Chemist (AOAC). TLC sigue siendo muy importante con fines de selección antes de la utilización de métodos que requieren de un personal más especializado y que además consumen más tiempo como los HPLC y la CG. Es una herramienta valiosa y de gran utilidad al trabajar con extractos muy limpios, de gran sencillez y rapidez y con buena capacidad de análisis semi-cuantitativo y cuantitativo gran cantidad de muestras simultáneamente, al carecer de poder de cuantificación y poca sensibilidad evoluciona y aparece la cromatografía en capa fina de alta resolución (High Performance Liquid Cromatography, HPLC), siendo más tarde combinada con la espectroscopia de masas (MS) formando la técnica HPLC-MS usada para separar las aflatoxinas de los tricotecenos, siendo una de las más avanzadas en la detección de micotoxinas sin embargo sus métodos resultan lentos y se requiere de mano de obra con conocimientos especializados, actualmente es una técnica común en los laboratorios donde otras métodos no están disponibles.

– Electroforesis Capilar (Capillary Electrophoresis, CE).- Presenta dos modalidaddes ampliamente más utilizadas:

• Electroforesis Capilar en Zona (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) que solo es útil para compuestos ionizados y,
• La Cromatografía Electrónica Micelar (Micellar ElectroKinetic Cromatography, MEKC) que puede separar compuestos ionizados y no-ionizados y siendo esta la más usada en análisis de aflatoxinas, fumosinas, zearalenona y patulina, esta técnica tiene dificultad en determinar las bajas concentraciones a las que se encuentran las micotoxinas en las muestras reales y la falta de selectividad cuando se utiliza un detector UV.

La electroforesis capilar útil tan solo en compuestos ionizados y la cromatografía electrocinética micelar que separa compuestos ionizados y no ionizados y la más usada en análisis de aflatoxinas, fumosinas, zearalenona y patulina, esta técnica tiene dificultad en determinar las bajas concentraciones a las que se encuentran las micotoxinas en las muestras reales y la falta de selectividad cuando se utiliza un detector UV.

– Cromatografía de Gases (CG).- Se ha desarrollado poco en el campo de las micotoxinas, además esta restricta a un número limitado de micotoxinas como los tricotecenos de tipo A y B porque carecen de propiedades fluorescentes, entre otras La CG separa los compuestos en función de su volatilidad y afinidad por la fase estacionaria, las micotoxinas son substancias poco volátiles y requieren de una derivación, es decir de productos químicos adecuados para su transformación en compuestos volátiles y así poder analizarlas, se pueden emplear métodos de detección de ionización de llama (FID) para poder omitir el paso de derivatización. Los detectores de CG más sensibles y específicos son los de detección de captura de electrones (ECD), columnas capilares y espectrometría de masas (MS).

– Cromatografía líquida (CL).- Es un método de alto rendimiento y fiabilidad para el análisis de una gran cantidad de compuestos termolábiles y de poca volatilidad como las moléculas grandes y altamente polares, a las que no es aplicable la cromatografía de gases. El proceso cromatográfico ocurre como resultado de una repetición de etapas de absorción/desorción durante el movimiento de los analito a través de la fase estacionaria. Los componentes de una muestra son separados por su distinta afinidad entre una fase estacionaria y otra líquida. Se usan detectores como la radiación ultra violeta que es poco selectivo; la detección con fluorescencia (FD) que es muy selectiva, la detección por barrido de iodos (DAD) y la espectrometría de masas (EM) para detecciones más fiables y específicas. Actualmente las fases de: Termonebulización (Thermospray, TSP), electronebulización (Electrospray, ES) considerada la más suave y principal, y por último la ionización química a presión atmosférica (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) son todas ellas las de mayor difusión. Los detectores espectrometría de masas en tándem MS/MS, la trampa iónica y el triple cuadrupolo prometen ser imprescindibles a futuro al menos en la confirmación de resultados positivos obtenidos por cromatografía líquida con detectores de radiación ultra violeta (UV) o detectores de fluorescencia (FD). Una forma más avanzada de la CL que utiliza alta presión para forzar a la muestra a través de la columna es la llamada cromatografía líquida de alta presión HPLC (High Performance Liquid Cromatography) que actualmente es el método más utilizado para la detección y cuantificación de micotoxinas de interés debido a su rendimiento y fiabilidad superiores si los comparamos con el TLC y la CG. La técnica HPLC-MS es una de las más avanzadas en la detección de micotoxinas, sin embargo sus métodos consumen más tiempo y requieren conocimientos especializados.

– Cromatografía de Líquidos de Ultra Resolución (UHPLC) se ha desarrollado hace relativamente pocos años, mejorando la eficacia al trabajar en altos flujos de la fase móvil sin perder la calidad de la separación cromatográfica, además de poder acoplarse a la detección de masas MS/MS, pudiendo analizar y determinar simultáneamente y en menor tiempo las micotoxinas de diversas familias.

– Técnicas de separación miniaturizadas
En los últimos años las técnicas de separación miniaturizadas han cobrado gran interés como métodos de Prevención y Control de Micotoxinas

El control y prevención de micotoxinas en alimentos está enfocado en dos principales estrategias, la primera el inhibir el crecimiento de hongos en el alimento (prevención de micotoxinas), y la segunda en la destrucción de estas, si es que ya están presentes en el alimento (detoxificación).

Se ha mencionado que las medidas de prevención es sin lugar a dudas un elemento de importancia decisiva para reducir la contaminación de hongos filamentosos productores de micotoxinas. Establecer estos controles preventivos depende del conocimiento previo de los factores que condicionan el crecimiento de los hongos tóxicos y sus diversas micotoxinas como por ejemplo el uso de equipos o productos químicos aprobados tales como fungicidas, fungistáticos e insecticidas, aunque en ocasiones resulten limitados por su eficacia y costes elevados y además pueden dar lugar a la contaminación del medio ambiente y perjudicar la salud de las personas, así también el uso de variedades de plantas resistentes tanto a los insectos como a los mohos productores de toxinas, tanto como controlar las sequias, la rotación apropiada de cultivos, la eliminación de malezas, la recolección y el secado (mediante chorros de aire, carros secadores, silos secadores y secadoras de sistema continuo).

IMPORTANCIA DE LA TRAZABILIDAD

El establecimiento de la llamada trazabilidad, implica la instauración de las Buenas prácticas agrícolas (BPA). Debe tenerse que la lluvia tardía o su exceso al momento de la cosecha y en periodos claves durante el crecimiento de las plantas y los vientos también influirán irremediablemente en la cantidad y origen de la contaminación fúngica. El uso de compuestos naturales antifúngicos como los antioxidantes y extractos naturales de plantas se presentan como una alternativa para contrarrestar el problema de la contaminación durante la pre y post cosecha, por su bajo costo y carácter inocuo para el hombre y la naturaleza, los extractos presentan un gran efecto antifúngico que es atribuido a una diversidad de metabolitos secundarios sintetizados por las plantas como mecanismos propios de defensa para contrarrestar el ataque de diversos microorganismos en la naturaleza siendo un buen ejemplo de medida de control el extracto de Thymus vulgaris (Tomillo) para hongos contaminantes de alimentos y sus micotoxinas, además está el control biológico mediante la selección de levaduras inocuas como agentes de control que eliminen o reduzcan el crecimiento y la producción de micoto­xinas, tal es el ejemplo de dos levaduras: Debaryomyces hansenii y Wickerhamomyces sp. que han demostrado su efectividad, afectando al crecimien­to del hongo y reduciendo la concentración de ocratoxina A (OTA) presente en el medio de cultivo.

Las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y Buenas Prácticas de Almacenaje (BPAL) son medidas que están enfocadas en la higiene y manipulación durante los procesos de empaquetamiento, almacenamiento, transporte e industrialización, donde influyen parámetros como la humedad, la actividad del agua, temperatura, ventilación, la aplicación de desinsectación, desinfección y desratización, evitando el daño mecánico y manteniendo el grano seco, sano y limpio para una buena y apropiada conservación con el fin de evitar la proliferación de los hongos micotoxigénicos en el almacenamiento como los de los géneros Penicillum, Aspergillus, Mucor y Rhizopus considerados de alta peligrosidad ya que son capaces de generar mayores daños que los de campo se 127control de micotoxinas en alimentación y salud pública deben alcanzar porcentajes de humedad menores al 12%, una actividad de agua debería ser menor de 0.7, la temperatura de 20 – 22o C y una adecuada ventilación con aire frío y húmedo. El uso de conservantes autorizados, por ejemplo los ácidos orgánicos como el ácido propiónico también pueden ser beneficiosos y de gran utilidad para los cereales destinados a la alimentación animal. Es también fundamental hacer una buena planificación y control permanente de registros y sistemas de monitoreo apropiados de la calidad del producto. Se han mencionado tres importantes niveles de acción, mediante los cuales se plantearían las acciones preventivas a ser ejecutadas para evitar o disminuir la formación del moho micotoxigénicos, estas son:

La Acción de Prevención de Primer Orden, se la emplearía antes de que la infección fúngica de los sustratos se haga presente. La Acción de Prevención de Segundo Orden, aplicable cuando la infección fúngica de material vegetal y la producción de micotoxinas es temprana o reciente y La Acción de Prevención de Tercer Orden que se la realizaría una vez que se determine que los productos se han contaminado fuertemente con el hongo, además, la eventual reducción de micotoxinas formadas en esta última fase a niveles aceptables es prácticamente inalcanzable, por lo que se recomienda de manera inmediata la destrucción de los productos contaminados. Hay que recalcar que no existen medidas de prevención eficaces si las condiciones ambientales favorecen el desarrollo de los mohos.

Factores sociales (culturales y políticos) así como factores económicos (macroeconómicos y microeconómicos) tienen una influencia importante en la aplicación exitosa de técnicas proyectadas para reducir o prevenir la contaminación de micotoxinas y mejorara la calidad de los alimentos y piensos, estas solo podrán aplicarse con éxito si es posible adaptarlas y aprovecharlas en el sistema socio económico existente.

Un adecuado sistema de gestión de seguridad alimentaria como los llamados Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC), servirán para poder identificar los sitios donde aparecerán los peligros más importantes para la seguridad del alimento (biológicos, físicos o químicos) en las diferentes etapas del procesado. Los APPCC tienen el objetivo de producir alimentos seguros todo el tiempo, proveer evidencias de que la producción es apta, generar confianza en el producto, satisfacer los requerimientos de los consumidores con respecto a la seguridad de los alimentos y adecuarse a la legislación vigente (8) . La metodología previa a su aplicación comienza con la formación del equipo APPCC integrada por personas con experiencia y formación adecuada; una descripción completa del producto ajustada a la legislación vigente; la descripción del consumidor al que va dirigido el producto como por ejemplo: ancianos, niños etc. y también los mercados de destino si son de tipo local, nacional o internacional; y por último la elaboración del diagrama de flujo y su verificación in situ (34) . Posteriormente se ha mencionado la aplicación y el mantenimiento del plan de APPCC que necesitara de siete principios que fueron estudiados y aceptados por organismos internacionales como la comisión del Codex Alimentarius 2002 y de la FAO en el año 2003

Los siete principios establecidos son:

1. Realizar un Análisis de Peligros.- Se lo realiza conforme a tres criterios: Gravedad del riesgo, frecuencia de aparición y la dificultad de detección.
2. Identificar los Puntos Críticos de Control (PCC).- Se puede aplicar un árbol de decisiones, para concluir en cual etapa o fase es crítico el control para la seguridad del producto.
3. Establecer un límite o Limites Críticos.- Esto nos permitirá saber, si la probabilidades de presentarse el o los peligros están o no controlados.
4. Establecer Procedimientos de Vigilancia.- Consiste en evaluar si un PCC está bajo control y producir registros precisos para en el futuro utilizarlos, mediante dos tipos de vigilancia básicas: El sistema fuera de línea (off- line) es mediante el cual se toman las muestras y se miden los factores críticos en otro lugar discontinuamente, y el sistema en línea es en el que los factores o límites críticos se miden continua o discontinuamente con intervalos de tiempo determinados durante todo el proceso.
5. Establecer Acciones Correctoras.- Es el procedimiento a seguir cuando se produce una desviación; como determinar y corregir la causa de no cumplimiento, determinar la disposición del producto que no cumple las especificaciones, registrar las acciones correctoras realizadas.
6. Verificación del Sistema APPCC.- Revisarlo por lo menos una vez al año y ver si funciona adecuadamente y cumple con los objetivos, si es así ratificarlo caso contrario cambiarlo.
7. Establecer un Sistema de Registro de Datos.- Que nos permita tener todos los datos de los productos que han estado bajo control, este registro debe incluir datos de los PCC, el peligro, el control, la vigilancia, los límites críticos, la acción correctora y el responsable de vigilar el proceso.

DESCONTAMINACIÓN Y/O DETOXIFICACIÓN

Se ha descrito a la Descontaminación y / o Detoxificación como un procedimiento mediante el cual las micotoxinas son eliminadas o neutralizadas de los alimentos en caso de su contaminación evidente sobre los alimentos, para lo cual se usan diferentes métodos, éstos son:

Métodos Físicos que separan y seleccionan granos de cereales dañados, decolorados o con una visible contaminación fúngica, además hay que mecánicamente o con técnicas electrónicas descascarillarlos y separar la cascara y el polvo del resto del cereal ya que una de las características de los cereales es que en su polvo y en el grano del pericarpio se encuentra la mayor concentración de micotoxinas. Los tratamientos mediante segregación por densidad y de flotación en medio acuoso, reducen muy significativamente el contenido de aflatoxinas (AFs) en granos de maíz y cacahuete, así como los niveles de deoxinivalenol (DON) y zearalenona (ZEA) en maíz y trigo (34) . Se han recomendado procesos basados en la degradación física mediante la Inactivación por Calor, con el inconveniente de la termorresistencia que las micotoxinas presentan, siendo necesarias temperaturas superiores a los 100oC para poder alcanzar la destrucción de las aflatoxinas, ocratoxinas, patulina, fumonisinas y zearalenonas entre otras presentes en las materias primas. Particularmente las aflatoxinas tienen altas temperaturas de degradación que van desde 237oC a 306oC. La vomitoxina o deoxinivalenol presentan una resistencia superior a los 150oC de temperatura, además hay que tomar en cuenta no solo a la temperatura si no también su tiempo de aplicación por lo que se tendría que emplear tratamientos térmicos a temperaturas elevadas y extensos periodos de tiempo. Por ejemplo, la torrefacción de los granos de café verde a 200oC durante 12 min provoca una reducción del 79% en el contenido de aflatoxinas, mientras que al cabo de 15 minutos, el 94% de la toxina se transforma en otros compuestos. Además se ha mencionado que el uso del calor para inactivar las micotoxinas en los alimentos contaminados puede ocasionar cambios en sus cualidades nutricionales y organolépticas (18) . Los agentes Adsorbentes son aquellos que tienen la capacidad de quelar las micotoxinas, lo cual permite reducir su disponibilidad, su incorporación como aditivos a la dieta alimentar de los animales favorece su eliminación por las heces previniendo la formación de las micotoxinas, aunque algunos aditivos presentan problemas por adsorber las vitaminas y minerales, los piensos que contienen este tipo de aditivos y que sirven como alimento en el ganado lechero permiten la detoxificación de la aflatoxina B 1 y así minimizan la transformación en el interior del vacuno de la AFB 1 en AFM 1).

Hay dos tipos principales de adsorbentes de micotoxinas:

Los Secuestrantes Inorgánicos o minerales que son generalmente arcillas o polímeros a base de cilice como las Bentonitas, Zeolitas, Tierra de diameas entre otros, poseen una afinidad hacia la zearalenona y la T-2 de tan solo el 30%., El carbón activado adsorbe diferentes micotoxinas con relativa eficacia (aflatoxina, ocratoxina A y fumonisinas) y los Adsorbentes Orgánicos que incluyen a los extractos de pared celular de levaduras o de bacterias acidolácticas y partes de plantas fibrosas. La utilización de adsorbentes de micotoxinas puede interferir en los resultados analíticos uso de suplementos diarios en los piensos (adsorbentes con capacidad antifúngica), también esta difundido el uso de suplementos en piensos como cepas de bacterias probióticas, entre las que destacan especies de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium que son capaces de minimizar por procesos metabólicos la concentración de aflatoxinas con la posibilidad de eliminarlas de las matrices contaminadas. (W), por último la Irradiación es una de las técnicas físicas empleadas aunque con su aplicación no se consiga destruir a las micotoxinas, como es el caso de la fumosina B 1 en la cual se ha aplicado 15 kGy de y-irradiación consiguiendo una reducción de tan solo un 20% de su contaminante.

Asimismo se ha investigado y descrito la radiación gamma en la inactivación de las aflatoxinas en la harina de maíz contaminada con AFB 1 la cual tuvo una reducción del metabolito entre el 75% y el 100% tras la aplicación de la radiación gamma a una dosis de 1 a 10 KGy respectivamente.

Métodos Químicos para inactivar aflatoxinas presente en alimentos se pueden utilizar sales inorgánicas y ácidos orgánicos, procesos de amonificación y la aplicación de agentes aglutinantes de la AFB 1, destacando el uso del hidróxido de calcio, de carbohidratos, de bisulfito, ozono, amoniaco o compuestos fungistáticos. En la actualidad el uso de amoniaco (amonificación) resulta ser el proceso más viable y económico para la descontaminación de productos de consumo animal, este procedimiento destruye un 90% de las aflatoxinas).

La Nixtamalización es un proceso precolombino de tratamiento del maíz para obtención de la masa y posterior fabricación de las tortillas de maíz tradicionales en México mediante la cocción de los granos de maíz en una solución acuosa de hidróxido de calcio (Ca(OH) 2 ), enfriando y efectuando sucesivos lavados para intentar remover el pericarpio y el exceso de Ca(OH) 2 se reduce del 75% al 90% el contenido de aflatoxinas del grano, transformándolas en metabolitos no tóxico como las aflatoxinas B 2a y G 2a. sin embargo, se ha sugerido que un alto porcentaje del contenido original de las aflatoxinas se revierten a su forma original toxica dentro del organismo luego de su digestión dadas las similares condiciones de pH encontradas en este medio, implicando un potencial riesgo para la salud humana. La aplicación de un Tratamiento Térmico y la adición de azúcares reductores permiten reducir la concentración de fumonisinas. Uno de los métodos promisorios es la Ozonización que degrada y descontamina el maíz de la presencia de aflatoxinas, asimismo se utiizan Fungicidas que inhiben el crecimiento y proliferación de los hongos micotoxigénicos, reduciendo o elimininando las micotoxinas por inhibición de la síntesis de varias enzimas a nivel de la célula fúngica, los productos más empleados son el ácido propiónico y sus sales cálcica y sódica.

Métodos Biológicos.- Los microorganismos no patógenos pueden se utilizados como agentes biológicos de control, así por ejemplo, mediante cepas fúngicas no aflatoxigenicas de Aspergillus flavus y A. parasiticus se logra una competencia natural con las cepas micotoxigénicas, produciendo una reducción en la contaminación por aflatoxinas cercana al 99%, en cacahuetes. Asimismo la AFB 1 presente en aceites vegetales, maíz y derivados se degradada tras la inoculación de Flavobacterium aurantiacum, además la aplicación de las mezclas probióticas preparadas con cepas de Lactobacillus y Propionibacterium reduce la presencia de aflatoxinas en la dieta.

La adición de Enzimas Biotransformadoras que modifica a la micotoxina en compuestos de menor toxicidad o ninguna toxicidad con respecto a la toxina original, los cuales serán excretados en la orina o en las heces y también pueden ser aplicadas a la materia prima para reducirla in situ.

En relación con el uso de plantas y sus Extractos Naturales y Aceites Esenciales para el control biológico, varias plantas medicinales han sido investigadas y evaluadas. Se ha detectado que la degradación de las aflatoxinas B 1 , G 1 , B 2 y G 2 por los extractos de Trachyspermun ammi puede alcanzar entre un 46% y 65 % en un tiempo de 6 a 24 horas de incubación, concluyendo que es un método seguro en la protección de la contaminación de aflatoxinas en alimentos destinados a aves de corral o ganado y otros productos agrícolas. Entre los extractos o aceites esenciales que destacan por su efecto inhibitorio fúngico y como degradador de micotoxinas podemos citar diversas especies de Rutáceas y de Labiadas.

CONCLUSIONES

Las micotoxinas generan un alto riesgo para la salud de las personas y animales ya que son un enemigo silencioso y su capacidad de contaminación es extensa. Es fundamental tener cuenta los procesos de: difusión, control y prevención, por lo que se debería disponer de una correcta información dirigida a todas las personas que forman parte de la cadena productiva de alimentos e indicarles de forma específica como se deben aplicar las normas de higiene ya establecidas.

Actualmente se propende a que los distintos procedimientos de análisis de micotoxinas sean encaminados a la utilización de la menor cantidad posible de solventes o disolventes, además que el tiempo de análisis sea reducido, exacto y que se procesen a la brevedad posible el mayor número de muestras, sin olvidarnos de los bajos costos que se requieren para que sean considerados como métodos ideales.

Es muy importante el uso de procesos sistemáticos preventivos como las APPCC antes de que se formen los mohos y sus micotoxinas, estos controles se deben dar en el campo a partir del momento del cultivo eligiendo semillas apropiadas, resistentes y sanas, así controlaríamos y disminuiríamos notablemente la posible contaminación por micotoxinas garantizando así una inocuidad lógica y objetiva de los alimentos.

Otro aspecto fundamental es la actualización sistemática de los reglamentos que regulan los límites de micotoxinas en los diversos alimentos, y su trazabilidad.

Los métodos de análisis de micotoxinas han sufrido cambios considerables, y la tendencia va encaminada a mejorar métodos ELISA para el screening, y la Extracción en Fase Sólida y sus variantes como la Microextracción en Fase Sólida, dada su versatilidad, que permite automatizar el sistema en serie o en paralelo y llevar a cabo un proceso dea extracción de hasta 400 muestras/h, para posteriormente usar las técnicas de confirmación cromatográfica como la CG, CG/MS, HPLC y la HPLC/MS, ya citadas.

Es evidente que el método más eficiente para evitar la contaminación por micotoxinas es la prevención. Por ello es fundamental poder combinar estrategias de prevención y control en la contaminación por hongos micotoxigénicos, observando y aplicando normas plenamente eficaces en la precosecha, desde el primer momento en el que se escoge la semilla. Ésta debe ser un hibrido de resistencia genética comprobada y llevar a cabo un seguimiento del producto, disponiendo una base de datos con información completa y apropiada para en caso necesario pueda ser utilizada, a lo que llamaríamos de trazabilidad del producto, además de instaurar un sistema centinela de alerta de detección precoz inmediata y de notificación dirigida a los organismos gubernamentales encargados en el tema.

También es fundamental la divulgación de información mediante folletos claramente informativos sobre el tema en los que se recomiende la aplicación de un proceso preventivo como son las normas APPCC, y se implemente de forma sistemática la realización der análisis rutinarios para detectar micotoxinas en las cosechas. No se deben olvidar las medidas de descontaminación y/o detoxificación ya existentes como son los métodos físicos, químicos y biológicos que podrían aplicarse de forma individual o combinada, estas ayudarían de manera preponderante en el control de las micotoxinas, protegiendo y garantizando la salud de las personas y animales.

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